服务简介 背景：单域抗体的人源化可以大幅降低驼源抗体的免疫原性，加速抗体药物的生产上市。为了克服传统单域抗体制备技术的制备周期长、筛选工作量大、候选抗体数量少的缺陷，三优隆重推出人源化程度高达98%的超万亿单域抗体库子库筛选服务。 方法：超万亿单域抗体库（Sanyou Super-Trillion Single Domain Antibody Library，ST-SDAL），采用国际先进的引物合成技术以及具有较好成药性的人源化骨架构建而成，子库库容高达2.50E+11 cfu，拥有独立知识产权，并匹配了全面的理化及生化分析进行筛选。 优势：仅需5-6周即可获得特异性好、亲和力高、序列明确并经真核表达验证的人源化单克隆抗体,人源化程度高达98%。 案例：超万亿单域抗体库子库自发布以来已经完成了12个不同难度靶点的验证；针对不同难度的靶点，平均可获得227个序列独特、特异性好、亲和力经验证的先导抗体克隆。 Fig. 1 不同难度靶点的先导分子数统计 服务内容 服务名称 服务详情 客户提供 交付物及标准 周期 超万亿单域抗体库子库筛选服务 1. 抗原鉴定 2. 抗原生物素标记 3. 超千亿人源化单域体库筛选 4. 抗体全长构建及表达纯化 5. 亲和力测定及成药性初步分析 靶点抗原或细胞株 1. 300个序列特异的先导分子 2. 先导分子抗体制备及验证 3. 优选分子抗体制备及验证 6-8 周 MIT羊驼单克隆抗体定制服务 1. 羊驼免疫 2. 免疫库构建 3. 高通量筛选 4. 真核表达验证 靶点名称、或靶点抗原、或细胞株 交付物： 1. 数十个先导抗体分子 2. 按需提供抗体小样 交付标准： 1. 抗体亲和力排序 2. 优选分子经亲和动力学或FACS验证 约4 个月 服务亮点 1. 人源化程度高 基于130多个分子的人源化项目经验积累，采用较好成药性的人源化骨架进行建库，所获单域抗体人源化程度高达98%。 2. 适应不同难度靶点 针对单次跨膜、多次跨膜和细胞因子等不同难度靶点均可获得大量的抗体分子，完美解决高难靶点的抗体药物筛选难题。 3. 高通量集成化，筛选效率大幅提高 采用固相和液相一站式高通量自动化筛选，极大的缩短了筛选时间，并且提高了筛选通量，筛选效率大幅提高。 4. 多样化、高通量筛选 针对不同抗原可制定Fc/His标签交叉、固液交叉、细胞蛋白交叉、竞争及阻断筛选等多种筛选策略，采用固、液相高通量快速获得先导抗体分子。 5. 真核表达，细胞水平活性验证 将先导抗体构建全长，通过CHO/293真核表达系统进行表达，进行生化理化分析以及细胞水平的功能验证，获得真实有效的成药性数据。 服务特性 1. 人源化程度高 三优构建的超万亿单域抗体库具有较高的人源化程度。通过130多个单域抗体分子的人源化项目经验积累，对单域抗体的骨架区（FR区）进行人源化改造，可以获得人源化程度高达98%的单域抗体，从而提高抗体的成药性。 2. 先导抗体数量多 通过三优超万亿单域抗体库筛选获得的纳米抗体先导分子数量多。通过12个不同靶点对ST-hSDAL进行筛选验证，如图Fig. 3所示，共获得2734个具有独特序列的人源化抗体克隆，所得克隆数中位值是235个。 Fig. 3 Antibody number per project 3. 先导抗体亲和力高 通过三优超千亿人源化单域抗体库筛选获得的纳米抗体候选分子具有较好的亲和活性。所获得抗体的亲和力往往可以达到pM。如图Fig. 4为构建全长后的分子亲和力分析，结果显示大部分抗体克隆都有较好的亲和力。 Fig. 4 Kinetics determination by ForteBio 4. 全面成药性分析 超千亿人源化单域抗体库筛选服务获得的分子构建全长后，对抗体的表达量及抗体的生化理化特性进行全面分析。如Table 1所示，包括纯度及浓度测定、一级结构分析和亲和力及亲和动力学等多个维度。 Table 1 Druggability of Antibodies from ST-hSDAL 类别 检测内容 检测方法 纯度及浓度测定 纯度鉴定 SDS-PAGE/SEC/CE-SDS 纯度及浓度测定 浓度鉴定 Protein A-HPLC/UV280 一级结构分析 分子量分析 LC/MS 一级结构分析 等电点 iCIEF 一级结构分析 疏水性鉴定 HIC-HPLC 一级结构分析 电荷异质性测定 CEX 一级结构分析 肽图分析 LC-UV-MS/MS 一级结构分析 N糖谱分析 LC/MS 亲和力及亲和动力学 亲和力检测 ELISA 亲和力及亲和动力学 亲和动力学检测 BLI/SPR 亲和力及亲和动力学 细胞结合检测（如有） FACS 案例展示 1. 抗CLDN18.2纳米抗体的开发 背景：CLDN18.2是构成紧密连接结构的一种膜蛋白，具有四次跨膜结构；其两个剪切变体CLDN18.1和CLDN18.2的氨基酸序列一致性高达91%。临床研究数据显示，70%的胃癌患者高表达CLDN18.2，且预后较差；CLDN18.2仅特异性表达于胃上皮细胞，其他健康组织中不表达。因此，开发特异性识别CLDN18.2的抗体药物，有望为胃癌患者提供精准安全的治疗。 1.1. 临床竞争格局 目前仅有一款针对CLDN18.2的抗体药物物处于三期临床，即IMAB362；其与紫杉醇联合用药的二期临床数据显示，CLDN18.2 过表达的胃食管癌病人用药后的总生存期从9个月提升到16.7个月。 1.2. 单克隆抗体MOA 抗CLDN18.2单克隆抗体与肿瘤细胞表面的CLDN18.2结合，以刺激激活抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性 (CDC)的细胞和可溶性免疫效应物。此外，抗CLDN18.2单克隆抗体还可以诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。 2. CLDN18.2抗体关键结果 2.1. 细胞水平的结合活性分析 通过超万亿单域抗体库子库筛选获得的纳米抗体候选分子候选分子大多具有较好的细胞水平结合活性。Fig. 5展示了采用FACS分析候选抗体与Human CLDN18.2-HEK293T细胞的亲和力测定结果，其中全部候选抗体的亲和力水平优于对照抗体。 Fig. 5 Binding affinity determination by FACS 2.2. 体外药效验证 2.2.1. ADCC和CDC分析 候选抗体由于包含有IgG1 Fc片段，可以通过抗体依赖的细胞毒性效应（ADCC）和补体依赖的细胞毒性效应（CDC）对靶细胞进行杀伤。如图Fig. 6所示，候选抗体C2对Human CLDN18.2-HEK293T细胞的ADCC杀伤效果与对照抗体相当；如图Fig. 7所示，候选抗体C2对Human CLDN18.2-HEK293T细胞的CDC杀伤效果与对照抗体相当。 Fig. 6 ADCC assay on Human CLDN18.2-HEK293T cell Fig. 7 CDC assay on Human CLDN18.2-HEK293T cell 2.2.2. 内吞作用分析 内吞作用是指膜表面抗原与抗体结合之后将抗体吞至细胞内部的过程。Fig. 8展示的是anti-CLDN18.2抗体介导的内吞作用将毒素递送入细胞后的毒性分析。结果显示，候选抗体C2可介导毒素对Human CLDN18.2-HEK293T的杀伤，且效果优于对照抗体。内吞作用结果指示候选抗体C2有可能用于ADC抗体药物的开发。 Fig. 8 Internalization assay on Human CLDN18.2-HEK293T cell 2.3. 体内药效验证 通过三优超万亿单域抗体库子库筛选获得的纳米抗体候选分子体内药效优秀，甚至优于对照抗体。免疫检查点A的候选分子在MC38人源化小鼠模型的体内抗肿瘤药效验证案例如Fig. 9所示。在人源化小鼠皮下接种MC38细胞，接种6天后开始进行药物治疗，治疗方式为腹膜内注射方式给药，每周两次，连续给药三周。结果显示：候选抗体（C2）在 0.4 MPK剂量时可完全抑制肿瘤生长，显示出了极其优异的抗肿瘤效果。