服务简介 背景：为克服鼠源性单抗的异源性反应，在嵌合抗体的基础上，对IgV区的框架区（FW）表面修饰，使其人源化，人源性可达90%以上。基于该技术，三优生物整合了计算机3D结构模拟以及数据库序列分析，推出了抗体深度人源化改造服务。 方法：抗体深度人源化改造服务整合了非人源序列3D结构模拟及分析、真核表达及纯化鉴定、亲和力及功能活性分析等技术，在维持抗体特异性与亲和力的前提下，最终获得人源化程度>95%的人源化抗体。 优势：基于计算机3D结构模拟，深度人源化，人源化程度均高达95%以上，回复突变数量小于6个。 案例：自2016年推出该服务以来，三优生物已完成超过200多例抗体人源化设计，其中40多例设计抗体处于临床申报阶段，7例处于临床试验阶段。 服务内容 服务名称 服务内容 客户提供 交付物及标准 周期 鼠源抗体人源化 1. 人源化设计 2. 基因合成 3. 载体构建 4. 真核表达 5. 质检分析 鼠源抗体序列、靶点蛋白及 对照抗体、鉴定用细胞株等 交付物：人源化序列、 蛋白、质粒及检测报告 4-6 周 驼源抗体人源化 1. 人源化设计 2. 基因合成 3. 载体构建 4. 真核表达 5. 质检分析 驼源抗体序列、靶点蛋白及 对照抗体、鉴定用细胞株等 交付标准：人源化比例>95%, 至少有一个抗体亲和力与母本 相似或者更好 4-6 周 兔源抗体人源化 1. 人源化设计 2. 基因合成 3. 载体构建 4. 真核表达 5. 质检分析 兔源抗体序列、靶点蛋白及 对照抗体、鉴定用细胞株等 交付标准：人源化比例>95%, 至少有一个抗体亲和力与母本 相似或者更好 4-6 周 服务亮点 1. 3D人源化设计，深度改造 基于3D 结构的抗体设计，应用独特人源化抗体数据库，以大量人源化数据为指导，可获得人源化程度>95%，最大程度降低抗体的异源性，并且保持其特异性和亲和力不变。 2. 独特的数据库，设计可靠 基于公司丰富的项目设计和验证数据，形成独特的人源化设计数据库。 3. 真核表达系统，接近天然 使用CHO或HEK293瞬转表达系统，所得抗体具有相对完整的翻译后修饰。 4. 项目经验丰富，成功率高 专家团队项目经验丰富，拥有160 多例抗体人源化设计经验，其中40多例设计抗体处于临床申报阶段，7 例处于临床试验阶段。 5. 4至6周交付，快速优质 从人源化设计、基因合成、质粒构建、蛋白表达、蛋白纯化到蛋白质检的一站式交付，仅需4-6周，处于行业领先水平。 案例展示 1. 鼠源序列3D结构模拟及模板分析 1.1. 3D结构模拟分析、表面电势分析、氨基酸残基分析 人源化改造后抗体及人源化改造前抗体的结构模拟分析和表面电势分析如下图所示。由图可知，人源化改造后的抗体的结构和人源化改造前的抗体的结构高度相似。 Fig. 1人源化改造后抗体及人源化改造前抗体的结构模拟分析和表面电势分析 1.2. Germline分析及确认 将鼠源序列基于独特数据库与人源Germline进行比对分析，选择一系列Germline模板进行鼠源位点确认。人源化模板通常基于鼠源序列选择成药性较好的4大类Germline（IGHV1/3和IGKV1/3）作为设计模板。 1.3. 鼠源序列免疫原性预测 基于公开数据库，主要对鼠源序列中与免疫细胞表面结合肽段的免疫原性进行分析。 1.4. 翻译后修饰位点预测 参考独特数据库进行翻译后修饰位点预测分析。 Modification Heavy Chain Variable Region （VH） Light Chain Variable Region （VK） Result Low Risk Medium Risk High Risk Low Risk Medium Risk High Risk Glycosylation / / / / / / Low Risk Glycation / K19 / / K49 / Medium Risk Oxidation W47 M3/M92 / / / / Medium Risk Deamidation / N56 / / / N76/N90 High Risk Isomerization D61 / / / / / Low Risk Fragmentation / / / / / / Low Risk Free Cystine / / / / / / No Free Cystine 2. 人源化抗体真核表达及纯化鉴定 鼠源抗体人源化一般会设计轻重链各3-5条序列，正交组合后会有9-25个人源化候选抗体组合，根据组合后风险评估优选10个左右组合进行真核表达验证，CHO或HEK293表达系统，10 mL体积表达5-7天，通过一步亲和层析纯化获得mg级样品供下游进行质检分析。 3. 人源化抗体质检分析 3.1. 人源化前后理化性质分析（SDS-PAGE/SEC/DSF） 抗体经三优生物人源化改造后，SDS-PAGE,SEC,DSF各项理化性质与母本一致。 Fig. 2 SDS-PAGE 抗体蛋白纯度> 90% Fig. 3 SEC 抗体蛋白主峰> 95% Fig. 4 DSF 以实际检测结果为准 3.2. 人源化抗体的抗原抗体结合活性分析（Gator/Biacore） 抗体亲和动力学结果对抗体的亲和力及成药性评价不可或缺，三优生物人源化改造能够在提高人源化比例的同时，保证抗体亲和动力学常数与母本基本一致。 Fig. 5A Affinity kinetic analysis of parental antibody (Gator) Fig. 5B Affinity kinetic analysis of parental antibody (Biacore) Table 1 Gator检测数据 抗体 KD (M) ka(1/Ms) kd(1/s) R2 母本抗体 3.39E-10 6.97E+04 2.36E-05 0.99 人源化抗体 4.10E-10 5.43E+04 2.23E-05 0.99 Fig. 6A Affinity kinetic analysis of humanized antibody (Gator) Fig. 6B Affinity kinetic analysis of humanized antibody (Biacore) Table 2 Biacore检测数据 抗体 KD(M) ka(1/Ms) kd(1/s) R2 母本抗体 3.98E-09 2.12E+05 8.44E-04 0.99 人源化抗体 2.47E-09 2.48E+05 6.11E-04 0.99 3.3. 人源化抗体的抗原抗体结合活性分析（FACS/ELISA） 鼠源抗体人源化改造前后抗体细胞水平结合及阻断活性测定结果如Fig. 7，Fig. 8所示。由图可知，人源化抗体（hu Ab1-8）与人源化前的母本分子(Parental Ab）的EC50值、上下平台值高度相似，表明其细胞水平结合及阻断活性与人源化前的母本分子（Parental Ab）高度相似。如Fig. 9，Fig. 10所示，人源化后的驼源抗体亲和力和母本相当。 Fig. 7 Comparison of the affinity of humanizedantibodies to parental antibody Fig. 8 Comparison of the blocking activity of humanized antibodies to parental antibody Fig. 9 Comparison of the affinity of humanizedantibodies to parental antibody Fig. 10 Comparison of the affinity of humanizedantibodies to parental antibody 4. 人源化抗体选择原则 优选人源化候选抗体选择的原则按照优选级排列如下： 1）抗原抗体结合或阻断功能（亲和动力学结果一般为母本3倍误差范围） 2）人源化程度（回复突变位点数量＜8个） 3）表达量及理化性质（表达量与母本抗体一致，理化性质与母本抗体一致）