服务简介 背景：创新抗体药研发过程中，原材料制备是药物研发第一环节，为了克服原材料中细胞株制备周期长、通量小、成功率低的缺陷，三优隆重推出研究用过表达细胞株构建服务。 方法：通过电转、化转及慢病毒感染等方式在CHO、HEK293及多种肿瘤细胞上构建过表达细胞株，并通过puromycin、hygromycin、G418及GS高表达筛选系统层层筛选，获得稳定高表达细胞株。 优势：仅需4-6周（转染开始），即可获得表达量高、稳定性好的过表达细胞池，6-8周可获得单克隆细胞株，且每次可同时批量构建30个细胞株。 案例：截止2022年4月，三优生物研究用细胞株构建平台已经完成上百个项目，覆盖分泌型抗原、抗体、膜蛋白及跨膜蛋白过表达细胞株，在CHO、HEK293及jurkat等多种细胞上成功构建过1000+过表达细胞株，90%细胞株能够稳定传代20个PDL。 服务内容 服务名称 客户提供 服务内容 交付物及标准 周期 研究用细胞株构建 基因序列 细胞池构建 高表达细胞池1-5 个 4-6 周 研究用细胞株构建 基因序列 单克隆细胞株构建 单克隆细胞株3-6 个 6-8 周 研究用细胞株构建 基因序列 细胞株建库（可选） MCB、WCB≥150 支 4 周 研究用细胞株构建 基因序列 细胞库稳定性研究 稳定性研究报告 8-10 周 服务亮点 1. 种类丰富： 构建分子类型多样、宿主细胞库资源丰富 可灵活构建分泌型抗原、抗体、膜蛋白、跨膜蛋白过表达细胞株及荧光素酶报告系统；以电转、化转及慢病毒感染等多种方式在CHO、HEK293及多种肿瘤细胞上进行稳定细胞株构建，并通过puromycin、hygromycin、G418及GS高表达筛选系统，获得稳定高表达细胞株。 2. 质量全面：RT-qPCR、FACS及PDL全面评估 构建的过表达细胞株通过Gator、HPLC、RT-qPCR和FACS分别在蛋白水平及基因水平检测细胞株过表达情况，连续传代20 PDL评价细胞株稳定性，并保证阳性率＞80%。 3. 快速高效：35天获得克级抗体，4-6周可获得稳定过表达细胞株 从载体构建开始，到交付克级抗体，最快仅需35天，最快约4周时间即可获得全面质量鉴定的可用于治疗产品开发的研究用过表达细胞株。 4. 用途广泛：可用于治疗产品开发整个流程 构建稳定细胞株模型，可用于后续基因功能研究和基因治疗研究；用于药物靶筛选、细胞信号传导通路分析及蛋白质相互作用；适用于体内实验，可用于裸鼠成瘤。 服务特性 1. 可构建多种类型过表达细胞株 三优研究用细胞株平台目前针对多种细胞系均已建立完善的细胞株构建工艺，可用于免疫、筛库及功能评价，过表达细胞株可批量化生产，4-6周即可交付质检合格的稳定过表达细胞株。 细胞株类型 可选细胞名称 转染方式 筛选压力 质控指标 膜/跨膜 蛋白过表达 细胞株 Jurkat、MC38、 THP-1、U937、 LLC、Raji、AGS、 NIH3T3、SNU16 慢病毒 感染 Puromycin Hygromycin G418 FACS ：阳性率>80% RT-qPCR：单细胞拷贝数>5 copies 稳定性>20 PDL HEK293 化学试 剂转染 Puromycin Hygromycin G418 FACS ：阳性率>80% RT-qPCR：单细胞拷贝数>5 copies 稳定性>20 PDL CHO-S 电转 GS高表达筛选系统 （MSX加压和无谷氨 酰胺培养基的双重筛选） FACS ：阳性率>80% RT-qPCR：单细胞拷贝数>5 copies 稳定性>20 PDL 荧光素酶 报告系统 Jurkat-NFAT、 HEK293-NFAT等 指定靶点类型 慢病毒 感染 Puromycin Hygromycin G418 FACS：信号通路有激活作用 分泌型抗原 /抗体过表达 细胞株 CHO-S、CHO-K1S、 CHOZN、CHO-K1Q 电转 GS高表达筛选系统 （MSX加压和无谷氨 酰胺培养基的双重筛选） HPLC：表达量>0.5 g/L SDS-PAGE：纯度>85% SEC：纯度>95% 2. 超过20个 PDL稳定性评估，确保阳性率＞80% 在克隆筛选阶段对12-24个克隆细胞株进行早期表达量评估，初步确定优选克隆后，对建库细胞进行20个PDL的稳定性评估，确保细胞库稳定性满足研究所需。 稳定性评估内容及标准 项目 稳定性评估 评估对象 终选克隆细胞株 评估内容 终克隆进行20个代次（PDL）的稳定性评估 细胞株传代稳定性 传代过程中细胞倍增时间应一致 细胞株生长稳定性 生长曲线应与种子细胞基本重合 细胞株生长稳定性 最高活细胞密度与种子细胞无显著差异 细胞株生长稳定性 细胞形态与种子细胞无显著差异 细胞株表达稳定性 蛋白及基因水平显示过表达，阳性率大于80% 细胞株表达稳定性 产品理化性质与活性与种子细胞一致 细胞株遗传稳定性 目的基因序列与种子细胞一致 细胞株遗传稳定性 基因拷贝数与种子细胞差异不超过30% 3. 团队成员经验丰富 三优研究用细胞株平台目前已累计构建1000+过表达细胞株，成功率高达100%，其中85%以上过表达细胞株阳性率达到80%以上；可灵活定制个性化靶点的Luciferase reporter system，并通过相关Assay进行功能验证。 Fig. 1 不同类型细胞株统计 4. 多重筛选保证最优克隆 分泌型细胞株：基于板式反应器、管式反应器、摇瓶、发酵罐等多重筛选体系，1000+克隆采用3轮Batch和3-4轮Fed batch逐步淘汰，确保获得高表达、稳定细胞株。 过表达细胞株（膜蛋白/跨膜蛋白）：基于96孔板、24孔板、12孔板、6孔板等多重筛选体系，RT-qPCR和FACS层层筛选淘汰，确保获得高表达、稳定细胞株。 Fig. 2 主要仪器设备 案例展示 1. 膜蛋白过表达细胞株构建 1.1. CHO细胞过表达细胞株鉴定数据 目的：在CHO细胞上构建过表达膜蛋白，用于筛库及功能验证。 方法：通过电转法将目的基因导入细胞，GS筛选系统两轮筛选，获得稳定过表达细胞株。 结果：过表达细胞株表达量较空细胞提高十万倍左右，且阳性率为99.9%。 结论：此过表达细胞株构建成功。 Fig. 3 CHO-S过表达细胞株FACS鉴定结果 1.2. HEK293细胞过表达细胞株鉴定数据 目的：在HEK293细胞上构建过表达膜蛋白，用于筛库及功能验证。 方法：通过电转法将目的基因导入细胞，Puromycin两轮筛选，获得稳定过表达细胞株。 结果：过表达细胞株表达量较空细胞提高十万倍左右，且阳性率为99.7%。 结论：此过表达细胞株构建成功。 Fig. 4 HEK293 过表达细胞株FACS鉴定结果 1.3. 肿瘤细胞过表达细胞株鉴定数据 目的：在肿瘤细胞NCI-N87上构建过表达膜蛋白，用于筛库及功能验证。 方法：通过慢病感染将目的基因导入细胞， Puromycin两轮筛选，获得稳定过表达细胞株。 结果：过表达细胞株表达量较空细胞提高万倍左右，且阳性率为100%。 结论：此过表达细胞株构建成功。 Fig. 5 NCI-N87细胞过表达细胞株FACS鉴定结果 2. 荧光素酶报告基因细胞株 2.1. PD-1/PD-L1 本报告基因细胞株体系采用2个细胞株，效应细胞株以Jurkat细胞作为宿主细胞，过表达人PD-1受体蛋白和NF-AT-LUC2反应原件，通过Puromycin和Hygromycin抗性基因筛选的单克隆细胞；aAPC细胞株以CHO-S细胞为宿主细胞，表达αCD3 ScFv抗体和PD-L1蛋白在细胞膜上。 Fig. 6 PD-L1荧光素酶报告基因检测体系原理示意图 Fig. 7 αPD-1/PD-L1拮抗剂抗体激活TCR信号 2.2. VEGF/VEGFR2 本报告基因细胞株体系采用HEK293细胞作为宿主细胞，过表达人VEGFR2受体蛋白和NF-AT-Luc2反应原件，通过Puromycin和Hygromycin抗性基因筛选得到的单克隆细胞。 Fig. 8 原理示意图 Fig. 9 重组人VEGF蛋白激活荧光素酶报告基因系统 Fig. 10 贝伐珠单抗中和重组人VEGF蛋白 3. 分泌型稳定细胞株构建 3.1. 表达量分析 目的：通过Bulk pool方法构建分泌型稳定过表达细胞池，用于克级蛋白生产。 方法：通过电转法将目的基因导入细胞，GS筛选系统加压筛选，获得稳定过表达细胞池。 结果：对39个项目的细胞池摇瓶期表达量进行统计，平均表达量为2.2 g/L，多个细胞池表达量高于3.0 g/L。 结论： 通过Bulk pool方式构建的过表达细胞池可在35天左右获得克级蛋白 。 Fig. 11 细胞池表达量分析 3.2. 细胞池摇瓶补料培养过程检测 目的：检测细胞表达过程各种参数指标，综合评估蛋白表达量及表达稳定性。 方法：细胞池接种到培养基中进行摇瓶补料培养，定期取样，检测活细胞密度、细胞活率、表达量以及乳酸、葡萄糖等代谢数据。 结果：细胞株活细胞密度最高可到2.5×107 cells/mL，培养14天后，细胞活率仍可维持在70%以上，抗体表达量可达3.4 g/L，乳酸始终维持在相对较低水平。 结论：细胞在表达过程中各项指标均符合规范要求。 Fig. 12 细胞池摇瓶补料培养